1.6&7 The Structure of DNA Polymerase
1.6&1.7 DNA聚合酶的结构——The Structure of DNA Polymerase
DNA聚合酶有很多种,大多数情况下,它们有着相同的基本结构,有些晶体学家叫它们“手”
Palm: 聚合酶结合引物-模板接头(PTJ)以及部分新合成的DNA
对所有聚合酶来说,这个结构有个有趣的特性,活性位点后面就是模板,黄色圈圈的是没配对的碱基,后面剩余的单链DNA呈$45度$弯曲,这很重要,因为那意味着活性位点附近唯一能配对的核苷酸,是紧接着前面配对完的那个,正与手掌发生着相互作用,手掌被认为是右边黄色大圈圈的区域
蛋白质如何结合所有的DNA?
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Binds Phosphate Backbone
它与固定且无关序列的磷酸骨架结合,如果我说主要作用不是在骨架上呢?那它会在哪里结合?
它会与大沟(major groove)结合。大沟里的氢键供体和受体有很多有趣的类型,它们的区别很大
A:氢键受体 D:氢键供体 M:甲基 H:非极性氢
受体-受体-供体-氢(AADH),氢是非极性的
氢-供体-受体-受体(HDAA)
受体-供体-受体(ADA),有个甲基(M),甲基会有很不一样的相互作用
甲基-受体-供体-受体(MADA)
按照你得到的碱基对,你能读到这个碱基对的所有信息,通过观察大沟,可以区分这是TA或是AT残基,或者分辨它是CG还是GC残基
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Interactions that non-sequence specific but watson/ crick base pair specfic in minor groove
我们喜欢小沟(minor groove),因为小沟除了中间的氢键不一样,每个碱基对两侧的氢键都是一样的,它们在完全相同的位置,无论碱基对是AT、CG、GC或是TA,小沟的氢键受体对都是一样的
在小沟中,其相互作用没有序列特异性,但有沃森-克里克碱基配对特异性,因为很多蛋白能非特异性地识别DNA,正是通过这种相互作用,这很重要,因为这使得聚合酶不仅能无视碱基对识别DNA,还能直接识别这就是碱基对
如果这里是AG,这就全乱套了,它们位置不对,聚合酶能察觉这点,如果这里是CC、CT或其它错配的碱基对,这使两个受体扭曲了,聚合酶会说“新合成的DNA不对”,它会对其作出反应,它不仅能检测出所有不同的序列,还能检测出碱基配对是不是正确,是不是遵循沃森-克里克碱基配对
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dNTP binding is mediated by base pairing and binding to divalent metal cations($Mg^{+2}$)
dNTP(核苷酸)结合是由碱基配对介导的,还螯合了二价金属阳离子,通常是镁离子,如果你用EDTA类的二价阳离子螯合剂,可以使任何DNA聚合酶失活
这是个准备掺入的核苷酸,这里会形成氢键(黄色粗线),氢键是结合核苷酸的一种方式,另一种则是三磷酸和一对二价金属阳离子间的作用,这可以在碱基配对外提供额外支持,把dNTP固定在正确位置,为催化提供条件
Finger Domain Closes On Bound dNTP
一旦上述图发生,另一件事情也会发生,那就是O-螺旋,这是fingers domain 指部结构的一部分。指部结构会在结合的dNTP周围开合,这就涉及O-螺旋,这是一种$\alpha$-螺旋
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O-helix($\alpha$-helix)
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Tyr-forms $\pi-\pi$ Bounds w/ Base ($\pi-\pi$键结合碱基)
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Lys-Arg Bind Triphosphate(赖氨酸和精氨酸结合三磷酸盐)
这是由于酪氨酸的环状结构与掺入的核苷酸之间形成了$\pi-\pi$键,相互作用发生在六元环状结构部分,无论是有一个六元环和五元环的嘌呤,还是仅有一个六元环的嘧啶,都能和酪氨酸(Tyrosine)发生反应,这能促使O-螺旋靠近dNTP
赖氨酸(Lysine)和精氨酸(Arginine)也是如此,它们会和$\beta$位及$\gamma$位的磷酸相互作用,这些相互作用使得O-螺旋被压下来,压在碱基对的上面,其重要的作用是防止水解发生,因此,这时候水就不能进入活性部位,那么唯一能发生的反应就是,羟基进攻磷酸基团(右图橙色线)
这里显示了加入新核苷酸时,中间体的真实晶体结构,橙色是O-螺旋,粉红色的是酪氨酸。蓝色是赖氨酸,红色是精氨酸,它们和二磷酸产生相互作用,黑色为$\alpha、\beta、\gamma$位磷酸,绿色的为两个金属离子,负责固定住三磷酸盐,紫色为primer
O-螺旋被压的很紧密,催化反应发生了,那么接下去会发生什么?
Release of Pyrophosphate Releases O-helix
释放焦磷酸盐和O-螺旋。当焦磷酸盐的$\beta、\gamma$位这两个磷酸被释放,对于位于此处的碱基的吸引力会弱很多,它就会弹回去,如果回到原来的状态,从👈这个有相互作用力的状态,回到👉这个没有相互作用力的状态
那么最后一件事情就会发生,那就是当我们将核苷酸添加到此,它就不会是原来的样子。这里就是一个碱基对,但碱基对和聚合酶之间没有很强的相互作用力,聚合酶希望这里黄色圈圈,而非下一个位置能有个3‘端羟基,这里怎么才能有个羟基?
把下一个单链DNA模板移动到这里,只需将DNA整体下移(中图),聚合物和这种形式(右图)的底物有较高相互作用力,中图到右图只需要移动一个位置,因为酶与双链DNA的相互作用是非碱基特异的
从能量的角度说,移动DNA的过程就相当于在手掌位置移动一个碱基对,移动一个碱基对不会改变与聚合酶间的相互作用力,但和3‘端羟基移动后的位置相比,原来的位置与聚合酶间的相互作用力要弱很多,移动一个碱基对就能让3‘端羟基到右图的位置,这个过程非常快,每加一个碱基只要一毫秒
当反应发生时,磷酸基为什么不留在原来的位置?
部分是因为它们不再和核苷酸相连了,原先核苷酸是和磷酸基相连的,一旦引物羟基在这里与磷酸结合,剩余的结合键就无法维持,这就是它们被释放的最主要原因,这时候就是因为熵,哪怕它们离开一点点时间,它们就永远离开了,因为不再有共价键了