1.8&1.9 DNA聚合酶发生的错误及修复——Mistakes of DNA Polymerase

犯错的频率是多少？为什么会犯错？

一个DNA聚合酶自身，大约每合成十万对碱基会发生一个错误

为什么会发生这么多错误？

但是其实大部分都不是DNA聚合酶本身的错，大多数错误都是嘧啶替嘧啶，或者嘌呤代嘌呤的错误

Due Tautomer Formation

这是由于互变异构体(Tautomer)的形成，展示两种不同的互变异构体，所有的四种碱基都能够在酮(keto)和烯醇(enol)、氨基(amino)和亚氨基(imino)式中相互转换

拿胞嘧啶(Cytosine)来说，通常它处于氨基(amino)的状态，但是在很罕见的情况下，它会变成亚氨基(imino)的状态，要注意的是，当它转变时，它的氢键模式也改变了，上面有受体、受体、供体，但转变后就突然变成了受体、供体、受体，这会改变它配对的碱基

酮式(keto)变成烯醇式(enol)，从供体、供体、受体变为供体、受体、受体。它的作用就是，当这种情况发生时，鸟嘌呤(Guanosine)正常的状态，这是它大多数时间保持的状态，是酮式(keto)状态，在它的酮态，它会完成自己的使命，它通过供体、供体、受体的位置关系和胞嘧啶配对

但基本上每十万个碱基中就有一个变化，它会罕见地转变为另一种构象，变为它的烯醇(enol)状态，它能与胸腺嘧啶(Thymine)紧密地连接

那么聚合酶做的工作就是，它通过接触碱基来弄清楚是否掺入到正确的位置，我还是得到了沃森克里克碱基配对，因为如果这里是腺嘌呤的话，结构也是一模一样的，当碱基变成另一种构象时，聚合酶无法区分出来

它很高兴这里加入了一个胸腺嘧啶，不幸的是，一旦你放进一个胸腺嘧啶，鸟嘌呤就不再是烯醇态了，它实际上非常快速地转变回酮态。酶会说“噢糟糕”，因为当它移动到下一个位置的时候，那个刚加进的碱基现在是错误的了，所以DNA不再会变成双链状态，它的末端会散开，它不再会形成小沟里面的相互作用方式，这会使聚合酶停止工作

考虑这个3‘羟基的位置，刚好能和这个$\alpha$磷酸基团相互作用，如果这个碱基对错误了，它们两个就会相互排斥，这大概就是氢键不再互补时发生的情况，那个羟基不会出现在$\alpha$磷酸基团需要的位置了

庆幸的是，一旦出现了错误，聚合酶会停下来并思考一下，互变异构体导致了错配，是暂时的，但是错配会减慢随后的合成，这会给聚合酶一点时间来改正自己，原来它使用校读型核酸外切酶(proofreading exonuclease)来修正，可以想象成聚合酶上的退格键或是删除键

proofreading exonuclease

校读型核酸外切酶是怎样工作的呢？

反应的示意图

这是否只是合成的逆反应？因为你可能会认为它是这样工作的，你只需让反应逆向进行对不对？为什么不能逆向进行？脱落下来的是脱氧核苷单磷酸，如果是逆反应，脱落下来的是脱氧核苷三磷酸，反应式顶端会有两个无机磷酸，如果幸运可能能找到一个焦磷酸，所以这不是逆反应

因为一旦你将那两个磷酸分开，合成反应就变得不可逆，酶其实可以聪明点，让一个焦磷酸留在附近一会儿，等着看合成的产物是不是正确，但是由于之前讨论过的原因，这实际上相当困难

proofreading exonuclease remove mismatches

exonuclease degrades DNA from one end

首先，一个核酸外切酶可以从一端删除，或者说降解DNA。

核酸外切酶的替代物是什么？hint: 在做克隆时，用什么来切DNA? 哪一种核酸酶？

核酸内切酶。核酸内切酶内部切开DNA片段，而核酸外切酶需要一个末端才能工作，一般来说，只会从末端开始，咬掉一点DNA
proofreading exonuclease acts 3’-5’ direction

校读型核酸外切酶沿3‘到5‘的方向工作，在这种情况下，我们无需担心别人不知道我们在说哪个方向，因为唯一可以供酶作用的就是一条DNA和它的3‘端，这段DNA处在双链DNA的哪里并不要紧，只要有一个3‘端，这些核酸外切酶就能降解它

这是一个3‘到5’方向的核酸外切酶，是与合成方向相反的，它从3‘端开始降解，而不是像DNA聚合酶一样从3‘端开始延伸
typically part of the same Polypeptide as Polymerase

当出现错配时，反应会变慢，除此之外，DNA末端就已经变得不稳定了，至少最后一个碱基对没能互补配对

通常外切酶活性与聚合酶活性都位于同一条多肽链上，因此，只要有校读型外切核酸酶活性，它就几乎总是属于一个双酶多肽，也就是说，这条多肽链一部分具有合成活性，而另一部分具有核酸外切酶活性
frayed/non BP end of DNA has low affinity for polymerase active site, single-stranded DNA end of primer - 3’OH end has high affinity for exonuclease active site

不稳定的或错配的DNA与聚合酶活性位点的亲和力很弱，但它有引物的单链DNA末端或3‘端羟基，于是与核酸外切酶的活性位点有高亲和力

具体示意图

这里有一个错配，它的末端散开了，对于聚合酶来说，这不是一个好底物，这段单链区域会从活性位点脱落下来，然后移动到手掌的根部，通常这里就是核酸外切酶的活性位点

一般来说，酶会去掉一至三个核苷酸，所以往往不仅移除了错配的碱基，也会多去掉几个核苷酸，这是没问题的，因为你会情愿把几个正确的核苷酸和错误的一起移除，然后重新合成，补上完全正确的，这样你只需关心有多少核苷酸需要重新合成

生物倾向于多付出一些来保证正确，而不是偷工减料而造成失误，付出一些努力来保证输出的正确是很值得的。

把它切掉后，这条单链DNA会重新退火(reanneal)，正确的结合整个模板，然后会将3’端羟基移动(shift)到合适的位置，以便继续合成

因此，这个不稳定的末端，对核酸外切酶来说是个不错的底物，一旦将它移除，就有了碱基完全互补配对的双链区域，将会很快退火，然后就会回到正常的合成反应

修复的作用有多大

proofreading exonuclease increases accuracy to 1 mistakes $10^7 /BP$

聚合酶中增加了校读型核酸外切酶活性，会使精确度提高100倍，所以每合成$10^7$个碱基对才会出一次错，现在距离最后的数值，我们只差3个数量级了。

在第五、六、七讲，我们将讨论DNA修复机制的工作原理，它能让你从$10^7$上升到$10^{10}$，尤其是错配修复(mismatch repair)

如果由于某种原因造成一个错配，但合成继续进行，不知为什么没有足够长的时间停下来，让校读型核酸外切酶工作，如果这段DNA某处最终形成了一个错配，一旦聚合酶延伸到这里，完全无法辨识出错配，只会继续合成下去

但是有一整套完全不同的机制，在基因组中在巡回并且寻找错配，事实上，错配就这样被识别出来，这就是这种修复方式的特别之处，它会找到那个错误的碱基，识别它并且把它移除，因为想象一下，一旦出现了错配，你没法想当然地知道，当一个C和一个T配对时，最初正确的是C还是T，细胞却有办法知道，我们会讲到它的工作机理的