1.8and9 Mistakes of DNA Polymerase
1.8&1.9 DNA聚合酶发生的错误及修复——Mistakes of DNA Polymerase
犯错的频率是多少?为什么会犯错?
一个DNA聚合酶自身,大约每合成十万对碱基会发生一个错误
为什么会发生这么多错误?
但是其实大部分都不是DNA聚合酶本身的错,大多数错误都是嘧啶替嘧啶,或者嘌呤代嘌呤的错误
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Due Tautomer Formation
这是由于互变异构体(Tautomer)的形成,展示两种不同的互变异构体,所有的四种碱基都能够在酮(keto)和烯醇(enol)、氨基(amino)和亚氨基(imino)式中相互转换
拿胞嘧啶(Cytosine)来说,通常它处于氨基(amino)的状态,但是在很罕见的情况下,它会变成亚氨基(imino)的状态,要注意的是,当它转变时,它的氢键模式也改变了,上面有受体、受体、供体,但转变后就突然变成了受体、供体、受体,这会改变它配对的碱基
酮式(keto)变成烯醇式(enol),从供体、供体、受体变为供体、受体、受体。它的作用就是,当这种情况发生时,鸟嘌呤(Guanosine)正常的状态,这是它大多数时间保持的状态,是酮式(keto)状态,在它的酮态,它会完成自己的使命,它通过供体、供体、受体的位置关系和胞嘧啶配对
但基本上每十万个碱基中就有一个变化,它会罕见地转变为另一种构象,变为它的烯醇(enol)状态,它能与胸腺嘧啶(Thymine)紧密地连接
那么聚合酶做的工作就是,它通过接触碱基来弄清楚是否掺入到正确的位置,我还是得到了沃森克里克碱基配对,因为如果这里是腺嘌呤的话,结构也是一模一样的,当碱基变成另一种构象时,聚合酶无法区分出来
它很高兴这里加入了一个胸腺嘧啶,不幸的是,一旦你放进一个胸腺嘧啶,鸟嘌呤就不再是烯醇态了,它实际上非常快速地转变回酮态。酶会说“噢 糟糕”,因为当它移动到下一个位置的时候,那个刚加进的碱基现在是错误的了,所以DNA不再会变成双链状态,它的末端会散开,它不再会形成小沟里面的相互作用方式,这会使聚合酶停止工作
考虑这个3‘羟基的位置,刚好能和这个$\alpha$磷酸基团相互作用,如果这个碱基对错误了,它们两个就会相互排斥,这大概就是氢键不再互补时发生的情况,那个羟基不会出现在$\alpha$磷酸基团需要的位置了
庆幸的是,一旦出现了错误,聚合酶会停下来并思考一下,互变异构体导致了错配,是暂时的,但是错配会减慢随后的合成,这会给聚合酶一点时间来改正自己,原来它使用校读型核酸外切酶(proofreading exonuclease)来修正,可以想象成聚合酶上的退格键或是删除键
proofreading exonuclease
校读型核酸外切酶是怎样工作的呢?
反应的示意图
这是否只是合成的逆反应?因为你可能会认为 它是这样工作的,你只需让反应逆向进行 对不对?为什么不能逆向进行?脱落下来的是脱氧核苷单磷酸,如果是逆反应,脱落下来的是脱氧核苷三磷酸,反应式顶端会有两个无机磷酸,如果幸运可能能找到一个焦磷酸,所以这不是逆反应
因为一旦你将那两个磷酸分开,合成反应就变得不可逆,酶其实可以聪明点,让一个焦磷酸留在附近一会儿,等着看合成的产物是不是正确,但是由于之前讨论过的原因,这实际上相当困难
proofreading exonuclease remove mismatches
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exonuclease degrades DNA from one end
首先,一个核酸外切酶可以从一端删除,或者说降解DNA。
核酸外切酶的替代物是什么?hint: 在做克隆时,用什么来切DNA? 哪一种核酸酶?
核酸内切酶。核酸内切酶内部切开DNA片段,而核酸外切酶需要一个末端才能工作,一般来说,只会从末端开始,咬掉一点DNA
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proofreading exonuclease acts 3’-5’ direction
校读型核酸外切酶沿3‘到5‘的方向工作,在这种情况下,我们无需担心别人不知道我们在说哪个方向,因为唯一可以供酶作用的就是一条DNA和它的3‘端,这段DNA处在双链DNA的哪里并不要紧,只要有一个3‘端,这些核酸外切酶就能降解它
这是一个3‘到5’方向的核酸外切酶,是与合成方向相反的,它从3‘端开始降解,而不是像DNA聚合酶一样从3‘端开始延伸
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typically part of the same Polypeptide as Polymerase
当出现错配时,反应会变慢,除此之外,DNA末端就已经变得不稳定了,至少最后一个碱基对没能互补配对
通常外切酶活性与聚合酶活性都位于同一条多肽链上,因此,只要有校读型外切核酸酶活性,它就几乎总是属于一个双酶多肽,也就是说,这条多肽链一部分具有合成活性,而另一部分具有核酸外切酶活性
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frayed/non BP end of DNA has low affinity for polymerase active site, single-stranded DNA end of primer - 3’OH end has high affinity for exonuclease active site
不稳定的或错配的DNA与聚合酶活性位点的亲和力很弱,但它有引物的单链DNA末端或3‘端羟基,于是与核酸外切酶的活性位点有高亲和力
具体示意图
这里有一个错配,它的末端散开了,对于聚合酶来说,这不是一个好底物,这段单链区域会从活性位点脱落下来,然后移动到手掌的根部,通常这里就是核酸外切酶的活性位点
一般来说,酶会去掉一至三个核苷酸,所以往往不仅移除了错配的碱基,也会多去掉几个核苷酸,这是没问题的,因为你会情愿把几个正确的核苷酸和错误的一起移除,然后重新合成,补上完全正确的,这样你只需关心有多少核苷酸需要重新合成
生物倾向于多付出一些来保证正确,而不是偷工减料而造成失误,付出一些努力来保证输出的正确是很值得的。
把它切掉后,这条单链DNA会重新退火(reanneal),正确的结合整个模板,然后会将3’端羟基移动(shift)到合适的位置,以便继续合成
因此,这个不稳定的末端,对核酸外切酶来说是个不错的底物,一旦将它移除,就有了碱基完全互补配对的双链区域,将会很快退火,然后就会回到正常的合成反应
修复的作用有多大
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proofreading exonuclease increases accuracy to 1 mistakes $10^7 /BP$
聚合酶中增加了校读型核酸外切酶活性,会使精确度提高100倍,所以每合成$10^7$个碱基对才会出一次错,现在距离最后的数值,我们只差3个数量级了。
在第五、六、七讲,我们将讨论DNA修复机制的工作原理,它能让你从$10^7$上升到$10^{10}$,尤其是错配修复(mismatch repair)
如果由于某种原因造成一个错配,但合成继续进行,不知为什么没有足够长的时间停下来,让校读型核酸外切酶工作,如果这段DNA某处最终形成了一个错配,一旦聚合酶延伸到这里,完全无法辨识出错配,只会继续合成下去
但是有一整套完全不同的机制,在基因组中在巡回并且寻找错配,事实上,错配就这样被识别出来,这就是这种修复方式的特别之处,它会找到那个错误的碱基,识别它并且把它移除,因为想象一下,一旦出现了错配,你没法想当然地知道,当一个C和一个T配对时,最初正确的是C还是T,细胞却有办法知道,我们会讲到它的工作机理的