2.1 DNA复制检测——Incorporation Assay

你如何分辨给你的澄清溶液？

因为大部分酶类都是无色的，所以生物学家们经常要和澄清溶液打交道，少数和离子、绿色荧光蛋白(GTP)或其它荧光蛋白结合的有颜色，但对于大部分酶而言，如果是纯溶液，它就是澄清的，更重要的是，除非上面有标签，不然你不会得到任何提示那是什么，大多数情况下，当你试图了解某个复杂反应，是不会有相关的标签出现的。你只有一些试管，不知道内容物是否有酶活性，那么怎样检测DNA的合成呢？

  • Assay For DNA Polym Activity —— DNA聚合酶活性的检测方法

    1. Simple Incorporation Assay

      • 应用

        基本上这种方法可以用于任何聚合物，不仅可以用于生物方面，还可以用在任何其它聚合物合成方面，可以用这种方法检测聚合物的形成和合成情况

      • 要求——Need To Be Able To Separate Polymer(DNA) From Its Building Blocks(dNTP)

        需要你能把聚合物从原料中分离出来，这个例子聚合物就是DNA

        尽管我们在讨论DNA复制时首先提到这个方法，但这个方法同样可用于转录、蛋白质合成方面，以及其它你能想到的各种形式的聚合物合成

        比如用在检验糖原合成，糖原合成也是一种聚合物合成反应

      • How to do it?

        1. Create A PTJ Substrate —— 要合成具有引物-模板接头的底物

          首先要有一个primer:template junction(引物-模板接头)，因为任何DNA合成反应都需要这个，要合成具有引物-模板接头的底物。

          在DNA合成反应中，人们一般会使用噬菌体M13，他有一个大的单链DNA基因组，你能合成这些环状单链DNA，我们知道噬菌体基因组的序列，这样你就能合成它了

          对于M13来说，它的DNA环有5000碱基，你可以合成一段与之不成比例的引物，通常引物有20-25个碱基对，这样我们就有了引物-模板接头。箭头一端与DNA聚合酶扩增的方向一致，总是3’OH，另一端则是5’磷酸基

          怎么获得引物呢？

          如今只要把引物输入电脑发送给公司，他们会为你合成引物，第二天早上就可以送到你手里，无论想要什么序列，只要长度小于50个碱基对，第二天就能拿到

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          有了引物-模板接头，把引物和单链DNA放在一起，合成底物，用加热板将其加热到100度，大约需要3分钟左右，然后取出加热板，然后去吃个午饭，回来就完成退火了

        2. Add Buffer + DNA Polym

          加入反应所需的缓冲液，对于大多数聚合酶而言，缓冲液通常是中性的，常含有50-100毫摩尔的盐，以及醋酸镁或氯化镁或其它的含镁溶液，通常需要大约1-2毫摩尔

          这样有了合适的缓冲环境，再加上DNA聚合酶

        3. Start Run By Adding dNTPs

          — Atleast One dNTP Must Be Label

          — Fluorescent or Radioactive Label 荧光标记或放射性同位素标记

          加上dNTP开始反应，这个检测的关键是至少要有一种被标记的dNTP，通常可以是荧光标记或放射性同位素标记

          荧光标记几乎总是加在一个胸苷类似物上，因此它是加在碱基上，实际上，只要胸苷上的甲基在那里，你就可以在甲基上加上几乎任何你想放的东西，加的东西可以很大，可以在甲基末端连上一个类似七环的结构

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          放射性同位素标记，可以用氚替换碱基上的氢，或者用P32替换其中一种磷酸基，修饰$\alpha$，因为 $\beta或\gamma$不是产物的一部分

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        4. Take Time Points And At Each Time Points Separate(Stop Run With EDTA or SDS) DNA From Labeled dNTPs

          反应继续，因为所有的组分都在里面，一般来说，你能取时间点，在每个时间点通常就加入SDS或其他物质来终止反应或者可以加入EDTA，你可以终止反应

          在每个时间点，你要把DNA从标记过的dNTP中分离出来

          如果合成反应成功进行，一部分标记过的dNTP就会掺入DNA聚合物中，所以要用一个有效的方法分离DNA和那些标记过的dNTP，然后在那个时间点，我们只需测量DNA中有多少被标记的dNTP，测量方法

          如果假设我们正在观察这个底物，大部分或所有DNA一开始都没有被标记，接着当我们合成新DNA的时候，新DNA被标记了，只需要找到方法分离那些粉红色DNA和漂浮在周围的粉红色小核苷酸，这样的方法其实有很多种，至少有几种

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