2.2 & 2.3 Filter Binding Incorporation Assay & Electrophoresis Incorporation Assay

How To Separate DNA From dNTPs

1. Filter Binding Assay —— 滤纸结合分析

最老套但也可能是最容易定量的一个

— Positivecy Charged Filter Paper(DE-81)

总的来说，你要用一张带正电荷的滤纸，一般来说是一种叫做DE-81的滤纸或者其他种类的滤纸

— Spot Run On Paper

把反应物点样到纸上，好处是能使这个反应速战速决，因为他会很快变干，干掉的反应是无法进行下去的，继续反应需要水

— Wash With Buffer That Has Salt At Level That Releases dNTPs But Not DNA

然后就能拿着这张膜，用含盐的缓冲液漂洗，盐浓度应该能够洗脱dNTP，而不能洗脱DNA

为什么它能分清楚这两者呢？

因为平均每个核苷酸上有3个负电荷
虽然通常在短时间内，一个磷酸有可能会多带一个负电荷，但一般来说，平均每个磷酸只带一个负电荷，所以一个dNTP有三个负电荷
那么这里的DNA底物有多少负电荷？
即使没有发生合成，它的负电荷也多于5000个，因为它上面的每一个碱基都有一个负电荷，那么DNA就会有比如说几千

下面来论证一下

要想使一个分子从滤纸上洗脱，必须使它所有的负电荷同时从滤纸上脱落，盐(离子)能做到这一点，因为当它趋近并结合(DNA)时，它会取代滤纸上的正电荷
比如说，我们用氯化钠，钠离子会过来并占据这个位置，但它一次只能占那么多，这取决于不同的盐浓度，但这一般都发生得很快，当只有三个负电荷时，比如说每两到三毫秒其中一个电荷会脱落，总体上这对于所有的电荷都是差不多的，这意味着比如说大约每过五秒，这三个电荷会在某一时刻被同时释放，但是5000个电荷会被同时释放的可能性几乎是0，所以你只需要漂洗它们
一般来说洗三次，通常会用放射性同位素标记来进行这个实验，这样就可以取上清液，可以检查上清液中能否检出放射性，然后就一直重复这个过程，直到滤纸的洗脱液中检测不到放射性为止，然后你只需取出滤纸，然后测定滤纸上吸附的标记物的含量
如果是荧光标记，测起来可能没那么简单，但是原理是一样的，洗三次就完成了。如果选对盐浓度DNA就从不易洗脱变成了无法洗脱，一般洗脱dNTP会用50毫摩尔的NaCl，它立刻就能掉下来，而DNA在这样的条件下永远无法被洗脱，你可能需要2-3摩尔的盐才有可能洗脱DNA之类

— Count Or Measure Fluorescence Or Radioactivity Associate

你就能取出这张膜，然后计数或者说测量它上面吸附的荧光或放射性强度，接着就能计算出掺入的核苷酸的含量，可以精确到飞摩尔(femtomole)甚至阿摩尔(attomole)

如果你准确地知道实验最初用的核苷酸上携带的荧光或放射性标记物的强度，那么你就能很精确地测量出有多少核苷酸掺入到了你的模板上，这个方法的优势就在于迅速，整个过程大约八分钟就可以完成了

优点 —— Fast, Quantitative

如果你排除了液体闪烁计数法(scintillation counting)或者测量荧光强度的某方法所需的时间，他快的简直不可思议，每次漂洗只需30秒，然后使其干燥，然后进行液体闪烁计数，这个方法也是定量的

而且当你分析在多长的时间内向多少模板中掺入多少核苷酸这类问题时，这几乎是定量准确性最高的一种方法了
缺点 —— No Information About Length

它无法提供任何有关长度的信息，无论是1000个10碱基对的延伸，还是一次10000碱基对的延伸，在这个分析实验中都会得到完全相同的结果，用这个分析实验无法区分这两者，你只能测出掺入了多少核苷酸，却不能确定产物到底是什么样的

所以这个分析实验一般只用于分级分离(fractionating)时，你只想找出聚合酶在哪个组分中，因为它真的很快捷，比如，当你从某细胞的粗提物中获得100份不同的柱层析组分时，你用这个分析实验就能迅速地判断出这就是含有DNA聚合酶活性的那个组分

2. Gel Electrophoresis

很多时候我们想知道片段有多长，如果你想知道这些产物多长，你怎么把它们分开呢？

用凝胶来分开。这种情况下，我们进行完全一样的反应，但在反应最后我们要分离产物

Separate products on A Gel(Denaturing)

如果DNA变性呢？如果我迫使新生链从5000碱基对的环状产物中脱离呢？我是不是就能更好地测量距离或者长度了？

这就是凝胶的关键，变性。你怎样使它变性呢？
- Heat + NaOH(Agarose) or Urea(Polyacrylamide)
  
  通常是95度，如果是用琼脂糖凝胶，通常会需要氢氧化钠，如果用聚丙烯酰胺，就要加尿素
  
  这些试剂的作用是，一开始它们并不能完全导致产物分离，这就需要加热的作用，它们能非常有效的阻止分离的DNA分子再次退火
  
  一旦把它们热变性了，如果它们处在碱或者尿素中，它们就无法恢复结合状态，也不能再次退火，然后你就用凝胶上分离它们，结果会是怎么样的呢？
  
  如果你只是用溴化乙锭(ethidium bromide)染胶（能染所有的核酸），无论它们是否被标记，这里显示的是离心管里所有的DNA。在反应之前加的引物，是最下面这个25碱基对的短条带，上面第二行是5000碱基对的模板，它们已经分离，所以它们的电泳位置完全不同。它们从上往下迁移，下面是正极，上面就是负极，较大的分子移动得慢，较小的分子移动得快
  
  合成开始以后，核苷酸会掺入到新的DNA链中，这就会慢慢分开，30秒时你会看见一些合成的产物，60秒时则更多，90秒，120秒，它会稳定地延伸这些初始引物的长度
  
  从这张图上能看见全部(DNA)，这也是一个非常高效的反应，通常这个反应不会用掉所有的模板，可以看到这里大概三分之二的模板被用掉了，这可以用溴化乙锭染色来检测
  
  但是如果我们只检测放射性或者荧光，我们就只能看见延伸中的DNA分子，看不见引物，反应初始的引物并没有被标记，看不见模板，初始的模板也没被标记，只能看见新的产物
很明显，与滤纸结合分析法相比，凝胶电泳给我们提供了很多新的信息
- 优点 —— Length Information
  
  告诉我们关于产物长度的信息，如果我们只合成了100碱基对的产物，如果这个聚合酶再也无法合成更长的产物，我们看到的图像就会与这里显示的持续合成的图像完全不同
- 缺点 —— Slower、Less Quantitative
  
  它更慢，不管是丙烯酰胺还是琼脂糖凝胶，根据胶的种类，至少需要20分钟，最长几个小时，定量效果也较差，测量胶上的带比测量掺入到模板中的放射性的总量要难多了
  
  比如说，通过测量放射性你能得到非常精确的数值，但这(电泳条带的定量)只是大概的估计，只能给你一些idea
当产物越来越长，信号的强度也越来越强，因为越来越多标记的核苷酸掺入到产物里