2.5 Processivity and 2.6 DNA Polymerase Processivity Assay
2.5 Processivity & 2.6 DNA Polymerase Processivity Assay
Processivity
DNA聚合酶的另一性质,这个性质叫做持续合成能力,它类似于描述聚合酶工作效率的意思,更精确的定义
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普遍定义
持续合成能力与作用于聚合物或者合成聚合物的反应有关,通常简单地定义为与每个聚合物分子结合的酶的反应循环数,所以这是作用于聚合物的酶的一种性质
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对于DNA聚合酶的定义
即在每次酶结合引物-模板接头时,加入的dNTP的个数
为什么要关心这个?
- 在溶液中DNA聚合酶结合引物-模板接头需要约一秒钟,这是扩散控制反应
- 与之相反,一旦结合后DNA聚合酶只需约一毫秒来添加dNTP
- 这意味着如果你有一个已经与模板结合的DNA聚合酶,在另一个DNA聚合酶与新模板结合期间,它能向模板添加1000个碱基对
- 显然,如果你想要合成大量DNA,你需要一个能有效持续合成的DNA聚合酶
事实上,DNA聚合酶在持续合成能力方面千差万别,它的差别基于聚合酶的功能
比如说,DNA修复聚合酶的持续合成能力很低,它通常只需要修复非常短的DNA片段,因此它们的持续合成能力为每次结合引物-模板接头时,合成10到20个碱基对,每次结合模板时,10到20个碱基对
相反,DNA复制或基因组DNA复制时,聚合酶具有不可估量的持续合成能力,我们那轻易合成的最大人工模板链的长度为50000碱基对,它们的持续合成能力在每次结合引物-模板接头时,高于50000碱基对
DNA Polymerase Processivity Assay
1. 模板竞争分析(template challenge assay)
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Make Two PTJ ——> 1 is Labeled On Primer ($P^*TJ$),1 is Not Labeled($PTJ$)
制备两种引物-模板接头,其中一种的引物经过标记,另一种的引物没有任何标记,我们需要这两种不同的引物-模板接头
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在标记过的引物-模板接头里
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Add 2x Excess Of DNA Polymerase Over $P^*TJ$——加入超过$P^*TJ$两倍的DNA聚合酶
如果有2皮摩尔的$P^*TJ$,我们就加入4皮摩尔的聚合酶
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Add Unlabeled dNTP + 1000x PTJ(unlabeled)
确保反应所需的缓冲液和其他条件都没问题,然后我们就在这些材料中加入未标记的dNTP来启动反应,同时还加入1000倍的未标记的引物-模板接头
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Allow Run To Proceed Long Enough To SyNT
让反应时间足够长,足以合成完整的模板,或者应该说是一个全长产物
在我们的例子里,这里指酶与模板结合一次以后,合成5000个碱基对,如果用之前讲过的超快的DNA聚合酶,每秒钟能合成1000个碱基对,这个反应只需要进行5秒
一般来说,酶不会有那么高效,所以我们可能要给他30秒来完成这个反应
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Stop Reaction And Separate Product On Denat Gel
终止反应,并在变性凝胶(denaturing gel)中分离产物
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得到如下结果,引物、高持续合成力的、低持续合成力的
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如果没有聚合酶,那就没有信号
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假设是5000碱基对片段的电泳位置,就会在5000碱基对的位置看到一个条带
如果有持续合成五万或五万多碱基对的高级聚合酶,我们就合成完整的产物
如果用了持续合成力低的酶,在40-45碱基对的地方可能会看到产物一片模糊(因为低效,没合成结束,就被终止了,合成的都是小片段分子,所以条带是散开的)
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阴性对照中,引物会在最左下角,一点都不会扩增,因为它是标记了的
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为什么这个反应可以让我们只关注酶的结合,只关注第一次结合之后会发生什么?
一开始所有标记过的引物-模板接头都结合了聚合酶,我们加入核苷酸启动反应,同时我们还加入了完全相同但未标记的引物-模板接头,加入的量是聚合酶的1000倍,聚合酶不会区分模板上是否连接了荧光或放射性标记物,所以他就开始合成了,然后根据酶的特性,它会以一定速率脱落
如果是一个持续合成力超强的酶,可能直到模板终点都不会脱落
如果是一个持续合成力弱的酶,它的持续合成力是20到25个碱基对,到了这个长度,他就从模板上脱落,它得花一秒钟时间去找一个新模板,一旦从模板上脱落,它就不一定只会重新结合原来的模板,还有同样的可能结合任何其他模板
它再次结合一个放射性标记模板的几率有多大?
千分之一,因此一般来说,它会结合一个未标记的模板,在那些未标记的模板上,它能愉快地继续合成更多DNA,我们在分析结果中看不到,我们只能在首次结合的模板时看到它,与仅有标记过的模板时的信号相比,重新结合标记过的模板产生的信号仅占千分之一,那就基本是0
由于加入了这些竞争性模板,这个实验被称为模板竞争分析,我们也因此只测量第一次结合和合成的情况,一旦它掉落到充满未标记模板的国度,我们就不管他了,所以这个方法非常快捷简单测量DNA聚合酶的持续合成力
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