2.5 Processivity & 2.6 DNA Polymerase Processivity Assay

Processivity

DNA聚合酶的另一性质，这个性质叫做持续合成能力，它类似于描述聚合酶工作效率的意思，更精确的定义

  • 普遍定义

    持续合成能力与作用于聚合物或者合成聚合物的反应有关，通常简单地定义为与每个聚合物分子结合的酶的反应循环数，所以这是作用于聚合物的酶的一种性质

  • 对于DNA聚合酶的定义

    即在每次酶结合引物-模板接头时，加入的dNTP的个数

    为什么要关心这个？

    • 在溶液中DNA聚合酶结合引物-模板接头需要约一秒钟，这是扩散控制反应
    • 与之相反，一旦结合后DNA聚合酶只需约一毫秒来添加dNTP
    • 这意味着如果你有一个已经与模板结合的DNA聚合酶，在另一个DNA聚合酶与新模板结合期间，它能向模板添加1000个碱基对
    • 显然，如果你想要合成大量DNA，你需要一个能有效持续合成的DNA聚合酶

    事实上，DNA聚合酶在持续合成能力方面千差万别，它的差别基于聚合酶的功能

    比如说，DNA修复聚合酶的持续合成能力很低，它通常只需要修复非常短的DNA片段，因此它们的持续合成能力为每次结合引物-模板接头时，合成10到20个碱基对，每次结合模板时，10到20个碱基对

    相反，DNA复制或基因组DNA复制时，聚合酶具有不可估量的持续合成能力，我们那轻易合成的最大人工模板链的长度为50000碱基对，它们的持续合成能力在每次结合引物-模板接头时，高于50000碱基对

DNA Polymerase Processivity Assay

1. 模板竞争分析(template challenge assay)

  • Make Two PTJ ——> 1 is Labeled On Primer ($P^*TJ$)，1 is Not Labeled($PTJ$)

    制备两种引物-模板接头，其中一种的引物经过标记，另一种的引物没有任何标记，我们需要这两种不同的引物-模板接头

    • 在标记过的引物-模板接头里

      1. Add 2x Excess Of DNA Polymerase Over $P^*TJ$——加入超过$P^*TJ$两倍的DNA聚合酶

        如果有2皮摩尔的$P^*TJ$，我们就加入4皮摩尔的聚合酶

      2. Add Unlabeled dNTP + 1000x PTJ(unlabeled)

        确保反应所需的缓冲液和其他条件都没问题，然后我们就在这些材料中加入未标记的dNTP来启动反应，同时还加入1000倍的未标记的引物-模板接头

      3. Allow Run To Proceed Long Enough To SyNT

        让反应时间足够长，足以合成完整的模板，或者应该说是一个全长产物

        在我们的例子里，这里指酶与模板结合一次以后，合成5000个碱基对，如果用之前讲过的超快的DNA聚合酶，每秒钟能合成1000个碱基对，这个反应只需要进行5秒

        一般来说，酶不会有那么高效，所以我们可能要给他30秒来完成这个反应

      4. Stop Reaction And Separate Product On Denat Gel

        终止反应，并在变性凝胶(denaturing gel)中分离产物

        • 得到如下结果，引物、高持续合成力的、低持续合成力的

          1. 如果没有聚合酶，那就没有信号

          2. 假设是5000碱基对片段的电泳位置，就会在5000碱基对的位置看到一个条带

            如果有持续合成五万或五万多碱基对的高级聚合酶，我们就合成完整的产物

            如果用了持续合成力低的酶，在40-45碱基对的地方可能会看到产物一片模糊(因为低效，没合成结束，就被终止了，合成的都是小片段分子，所以条带是散开的)

          3. 阴性对照中，引物会在最左下角，一点都不会扩增，因为它是标记了的

          Untitled

        • 为什么这个反应可以让我们只关注酶的结合，只关注第一次结合之后会发生什么？

          一开始所有标记过的引物-模板接头都结合了聚合酶，我们加入核苷酸启动反应，同时我们还加入了完全相同但未标记的引物-模板接头，加入的量是聚合酶的1000倍，聚合酶不会区分模板上是否连接了荧光或放射性标记物，所以他就开始合成了，然后根据酶的特性，它会以一定速率脱落

          如果是一个持续合成力超强的酶，可能直到模板终点都不会脱落

          如果是一个持续合成力弱的酶，它的持续合成力是20到25个碱基对，到了这个长度，他就从模板上脱落，它得花一秒钟时间去找一个新模板，一旦从模板上脱落，它就不一定只会重新结合原来的模板，还有同样的可能结合任何其他模板

          它再次结合一个放射性标记模板的几率有多大？

          千分之一，因此一般来说，它会结合一个未标记的模板，在那些未标记的模板上，它能愉快地继续合成更多DNA，我们在分析结果中看不到，我们只能在首次结合的模板时看到它，与仅有标记过的模板时的信号相比，重新结合标记过的模板产生的信号仅占千分之一，那就基本是0

        由于加入了这些竞争性模板，这个实验被称为模板竞争分析，我们也因此只测量第一次结合和合成的情况，一旦它掉落到充满未标记模板的国度，我们就不管他了，所以这个方法非常快捷简单测量DNA聚合酶的持续合成力