梁止潆的博客

2.3 文献数据库PubMed 引言 PubMed是啥？ MedLine —— PubMed 文献记录的内部结构 按照不同规则搜索Down这个词 按作者名 AU 搜索：Down [AU] 按标题 TI 搜索：Down [TI] 按实验室地址 AD 搜索：Down [AD] 在任意地方搜索：Down 关于使用 PubMed 的几个小建议： 使用引号（“down syndrome” ) 使用逻辑词 AND, OR, NOT（dUTPase [TI] AND bacteria [TI] NOT Smith [AU]) 使用正确的名字缩写 (“Abergel C”) 使用每篇文献唯一的 PubMed ID（PMID: 24933525)

2.1 为什么需要生物数据库&2.2 生物数据库分类 什么时候该用什么数据库，如何在数据库中查找想要的信息，以及如何解读这些信息 超过1000个物种通过测序技术获得了全部基因组序列 核酸数据库：与核酸有关的数据库 蛋白质数据库：与蛋白质有关的数据库 专用数据库：针对某一主题的数据库或综合性的数据库以及无法归入其他两类的数据库 一级数据库：存储的是通过各种科学手段得到的最直接的基础数据 比如测序获得的核酸序列，或者X射线衍射法获得的蛋白质三维结构 二级数据库：通过对一级数据库的资源进行分析、整理、归纳、注释而构建的具有特殊生物学意义和专门用途的数据库 比如从三大核酸数据库和基因组数据库中提取并加工的果蝇和蠕虫数据库，或者根据蛋白质三级结构数据库中的结构信息分析统计出的蛋白质结构分类数据库CATH、SCOP等

1. 简介 生物数据库 序列比较 分子进化系统发生 蛋白质结构预测与分析 基因组学 蛋白组学 序列算法 统计基础 数据挖掘

2.5 Processivity & 2.6 DNA Polymerase Processivity Assay Processivity DNA聚合酶的另一性质，这个性质叫做持续合成能力，它类似于描述聚合酶工作效率的意思，更精确的定义 普遍定义 持续合成能力与作用于聚合物或者合成聚合物的反应有关，通常简单地定义为与每个聚合物分子结合的酶的反应循环数，所以这是作用于聚合物的酶的一种性质 对于DNA聚合酶的定义 即在每次酶结合引物-模板接头时，加入的dNTP的个数 为什么要关心这个？ 在溶液中DNA聚合酶结合引物-模板接头需要约一秒钟，这是扩散控制反应 与之相反，一旦结合后DNA聚合酶只需约一毫秒来添加dNTP 这意味着如果你有一个已经与模板结合的DNA聚合酶，在另一个DNA聚合酶与新模板结合期间，它能向模板添加1000个碱基对 显然，如果你想要合成大量DNA，你需要一个能有效持续合成的DNA聚合酶 事实上，DNA聚合酶在持续合成能力方面千差万别，它的差别基于聚合酶的功能 比如说，DNA修复聚合酶的持续合成能力很低，它通常只需要修复非常短的DNA片段，因此它们的持续 ...

2.4 Primer Extension Assay 希望无论是10碱基对还是1000碱基对的产物，他们的标记量都相同，这就要用到一个不同的分析实验 这跟掺入法不同，这叫引物延伸实验，与掺入法不同的是，被标记的是底物，我们在引物中掺入荧光基团或放射性标记的核苷酸，这个引物从5’端到3‘羟基端和先前的引物都一样，因此合成了一个标记过的引物-模板接头 Make A Labeled PTJ (label on primer) Perform Run Same Way 标记通常必须位于引物上，因为合成完成后，引物就成为产物的一部分，而模板一旦分离，就不再属于产物了，反应完全是一样的 Do Not Label dNTPs 我们不标记dNTP，我们改变了标记方式，现在是在引物上，dNTP全是未被标记的 Can’t Analyze By Filter Binding 那么你运行反应，你不能用滤纸结合分析来检测 如果反应中完全没有DNA聚合酶，会有什么结果？ 滤纸上会有大量放射性标记的DNA，如果你完成了整个产物的合成反应，也会得到大量产物，因为起始产物和终产物被标记的数量基本相同 ...

2.2 & 2.3 Filter Binding Incorporation Assay & Electrophoresis Incorporation Assay How To Separate DNA From dNTPs 1. Filter Binding Assay —— 滤纸结合分析 最老套但也可能是最容易定量的一个 — Positivecy Charged Filter Paper(DE-81) 总的来说，你要用一张带正电荷的滤纸，一般来说是一种叫做DE-81的滤纸或者其他种类的滤纸 — Spot Run On Paper 把反应物点样到纸上，好处是能使这个反应速战速决，因为他会很快变干，干掉的反应是无法进行下去的，继续反应需要水 — Wash With Buffer That Has Salt At Level That Releases dNTPs But Not DNA 然后就能拿着这张膜，用含盐的缓冲液漂洗，盐浓度应该能够洗脱dNTP，而不能洗脱DNA 为什么它能分清楚这两者呢？ 因为平均每个核苷酸上有3个负电荷 虽然通常在短时间内，一个磷酸有可 ...

2.1 DNA复制检测——Incorporation Assay 你如何分辨给你的澄清溶液？ 因为大部分酶类都是无色的，所以生物学家们经常要和澄清溶液打交道，少数和离子、绿色荧光蛋白(GTP)或其它荧光蛋白结合的有颜色，但对于大部分酶而言，如果是纯溶液，它就是澄清的，更重要的是，除非上面有标签，不然你不会得到任何提示那是什么，大多数情况下，当你试图了解某个复杂反应，是不会有相关的标签出现的。你只有一些试管，不知道内容物是否有酶活性，那么怎样检测DNA的合成呢？ Assay For DNA Polym Activity —— DNA聚合酶活性的检测方法 Simple Incorporation Assay 应用 基本上这种方法可以用于任何聚合物，不仅可以用于生物方面，还可以用在任何其它聚合物合成方面，可以用这种方法检测聚合物的形成和合成情况 要求——Need To Be Able To Separate Polymer(DNA) From Its Building Blocks(dNTP) 需要你能把聚合物从原料中分离出来，这个例子聚合物就是DNA 尽管我们在讨论DNA复 ...

1.8&1.9 DNA聚合酶发生的错误及修复——Mistakes of DNA Polymerase 犯错的频率是多少？为什么会犯错？ 一个DNA聚合酶自身，大约每合成十万对碱基会发生一个错误 为什么会发生这么多错误？ 但是其实大部分都不是DNA聚合酶本身的错，大多数错误都是嘧啶替嘧啶，或者嘌呤代嘌呤的错误 Due Tautomer Formation 这是由于互变异构体(Tautomer)的形成，展示两种不同的互变异构体，所有的四种碱基都能够在酮(keto)和烯醇(enol)、氨基(amino)和亚氨基(imino)式中相互转换 拿胞嘧啶(Cytosine)来说，通常它处于氨基(amino)的状态，但是在很罕见的情况下，它会变成亚氨基(imino)的状态，要注意的是，当它转变时，它的氢键模式也改变了，上面有受体、受体、供体，但转变后就突然变成了受体、供体、受体，这会改变它配对的碱基 酮式(keto)变成烯醇式(enol)，从供体、供体、受体变为供体、受体、受体。它的作用就是，当这种情况发生时，鸟嘌呤(Guanosine)正常的状态，这是它大多数时间保持的状态，是酮式( ...

1.6&1.7 DNA聚合酶的结构——The Structure of DNA Polymerase DNA聚合酶有很多种，大多数情况下，它们有着相同的基本结构，有些晶体学家叫它们“手” Palm: 聚合酶结合引物-模板接头(PTJ)以及部分新合成的DNA 对所有聚合酶来说，这个结构有个有趣的特性，活性位点后面就是模板，黄色圈圈的是没配对的碱基，后面剩余的单链DNA呈$45度$弯曲，这很重要，因为那意味着活性位点附近唯一能配对的核苷酸，是紧接着前面配对完的那个，正与手掌发生着相互作用，手掌被认为是右边黄色大圈圈的区域 蛋白质如何结合所有的DNA？ Binds Phosphate Backbone 它与固定且无关序列的磷酸骨架结合，如果我说主要作用不是在骨架上呢？那它会在哪里结合？ 它会与大沟(major groove)结合。大沟里的氢键供体和受体有很多有趣的类型，它们的区别很大 A：氢键受体 D：氢键供体 M：甲基 H：非极性氢 受体-受体-供体-氢(AADH)，氢是非极性的 ...

1.5 DNA聚合酶的活性位点——The DNA Polymerase Active Site DNA聚合酶可以催化多少种反应？ 4种，每种核苷酸算作1种，例G催化C结合反应 但如果考虑到之前的碱基，引物也是底物的一部分，每个新来的核苷酸可以接在4种不同的核苷酸之上，如果先前的核苷酸也参与反应，如果前面是一个C，那么所进行的反应就会不同于G，或与嘌呤、嘧啶的反应都有区别。所以你们可以认为DNA聚合酶催化至少16种不同的反应 DNA聚合酶有几个活性位点？ 一个 尽管他催化很多种不同的反应，但它只有一个活性位点，那么一个活性位点如何催化多种dNTP呢？ 我们通常考虑到的酶与之不同，例如 如果你想要将亮氨酸换成精氨酸，或在合成这些氨基酸的时候加上一个羧基，给精氨酸和亮氨酸加羧基的过程，需要两种完全不同的酶来催化，这里只有一种酶却能做到这些，那他是怎么做到的呢？ DNA聚合酶是利用盲文来工作的，它之所以不关心是什么核苷酸在进行聚合，就是因为这种特性。DNA结构非常规律规整，这些中间蓝色区域的碱基对，每一对都是什么并不重要，它们看起来都一样，它们之间只有一些细微的差别，但是结构非常相似 ...